第一章 引 言

REV只有一个血清型，目前分离的毒株均具有相似的抗原性（Witter et al., 1970）。REV群可分为完全复制型（非缺陷型）和不完全复制型。目前REV群包括REV-T株、雏鸡合胞体病毒（Chick Syncytia Virus，CSV）、脾坏死病毒（Spleen Necrosis Virus，SNV）、鸭传染性贫血病毒（Duck Infective Anaemia virus，DIAV）和其他来自火鸡、鸡、鸭、雉和鹅的非缺陷分离株（Barbacid et al., 1979；Kang and Temin, 1973；Lovinger et al., 1981；Rice et al., 1981；Tsai et al., 1986）。REV容易整合到禽痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）、马立克病病毒（Marek’sdisease virus，MDV）等病毒基因组中，并通过禽蛋传递对疫苗造成不同程度的污染（Fadlyet al., 1996，1997；Jackson et al., 1977）。当鸡群接种这些污染的疫苗后，就会产生严重的免疫抑制现象。目前，REV感染在国内鸡群中已相当普遍，并呈混合感染和愈发严重的趋势（胡北侠等，2009；吉荣等，2001；姜世金等，2005；秦立廷等，2010）。研究表明，鸡群中MDV、鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）和REV等免疫抑制性病毒的混合感染的现象愈发严重，这也是导致如今养禽业生产性能下降的重要原因，给我国养禽业的健康发展造成了巨大的危害。我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将禽网状内皮组织增生病列为二类动物疫病。

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第二章 禽网状内皮组织增生病病毒对不同日龄 SPF 鸡的致病性研究

2.1 材料和方法

试验 I：取 1 日龄 SPF 鸡 120 只，分为 3 组，每组 40 只。组 1 攻毒 REV HLJR0901 株102TCID50/只，组 2 攻毒 REV HLJR0901 株 104TCID50/只，组 3 为 PBS 对照组。攻毒途径为腹腔注射，0.1 ml/只。试验前采血检测 REV 抗体滴度。攻毒后每周每组取 5 只鸡，称重，采血，剖检，采集法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃，称取各器官重量，计算器官指数。采集的各器官分为两部分，一部分用于检测病理变化，另一部分保存于-70 °C，用于 DNA 提取和病毒载量检测。试验 II，取 5 周龄 SPF 鸡 30 只，分为 3 组，每组 10 只。组 1 攻毒 REV HLJR0901 株102TCID50/只，组 2 攻毒 REV HLJR0901 株 104TCID50/只，组 3 为 PBS 对照组。攻毒途径为腹腔注射，0.1 ml/只。试验前和攻毒后每周采血检测 REV 抗体滴度和血液病毒载量。攻毒后 7 天和 28 天，每组取 5 只鸡，称重，采血，剖检，采集法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃，称取各器官重量，计算器官指数。采集的各器官分为两部分，一部分用于检测病理变化，另一部分保存于-70 °C，用于 DNA 提取和病毒载量检测。

2.2 结果

gp90 核苷酸序列比对显示，HLJR0901 株 gp90 基因与美国、中国台湾以及中国大陆的其他分离株的相似性均在 95%以上，表明 REV 各毒株 gp90 基因在进化过程以及地区分布上具有很大的保守型，这在一定程度上与目前市场上还没有 REV 的疫苗及有效的预防措施有关，在没有选择压力的情况下，REV 没有发生大的变异；另一方面，这为 REV 疫苗的研制提供了条件，只要对其中一个毒株的保护性抗原 gp90 基因进行表达，制备疫苗，就可以对其他毒株进行交叉保护。序列比对进一步显示，HLJR0901 株与中国东北其他分离株（JLR0801、JLR0901、LNR0801、HLJR0801、HLJ071）以及中国台湾分离株（3122-03、3295-04、3337-05、3410-06）相似性在 99.5%以上，而与中国海安分离株 HA9901 相似性相对较低（97%），这说明 REV 在我国的分布具有一定的地域性。同时上述毒株与从污染疫苗中分离的 REV 毒株 FA（FPV-REV，美国）和 MD-2（HVT-REV，中国）具有很高的相似性（99.7%以上），说明 REV 在美国和中国地区的流行与疫苗中 REV 的污染有很大关系。

第三章 禽网状内皮组织增生病病毒 gp90 蛋白在毕赤酵母中的表达及优化 ......27

3.1 材料和方法.................................. 28

3.2 结果........................ 34

第四章 禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗的免疫效力及安全性研究 ...........45

4.1 材料和方法................................. 46

第五章 禽网状内皮组织增生病 DNA 疫苗的构建及与亚单位疫苗的联合免疫 .....60

5.1 材料和方法.................61

第五章 禽网状内皮组织增生病 DNA 疫苗的构建及与亚单位疫苗的联合免疫

5.1 材料和方法

将制备的脾淋巴细胞加入到 96 孔微量培养板中，50 μL/孔，各试验组细胞中分别加入50 μL 含重组 gp90 蛋白（5 μg/mL ）的 RPMI 1640 培养液，各组阳性对照孔加入 50 μL 含Con A（5 μg/mL）的 RPMI 1640 培养液。每孔培养物总体积为 100 μL，每组设立 5 个重复孔。阴性对照孔只加 50 μLRPMI1640 培养液，同时设只含培养液的空白对照孔。将各组淋巴细胞置于 37 °C CO2培养箱中培养 48h。培养结束后取细胞上清，用鸡 IL-4 和 IFN-γ ELISA检测试剂盒检测培养上清中的细胞因子，按说明书操作进行。用酶标仪在 450 nm 波长下测量各孔 OD 值。依据标准品浓度及其对应的 OD 值绘制标准曲线的直线回归方程，再依据样品的 OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

5.2 结果

将构建的重组 DNA 疫苗质粒转染 DF1 细胞 48 h 后用 IFA 和 Western blot 检测插入的gp90 基因的表达。如图 6.1 所示，DNA 疫苗质粒转染孔 pCAGgp90、pCAGoptigp90、pCAGWgp90、pCAGWoptigp90 在 IFA 检测中均显示有绿色荧光，而空载体 pCAGGS 转染组没有荧光，表明 gp90 基因在构建的 DNA 疫苗重组质粒中获得了成功表达。IFA 试验的结果同时表明，pCAGoptigp90、pCAGWgp90、pCAGWoptigp90 质粒转染组的荧光强度明显高于 pCAGgp90 转染组（图 5.1）。Western blot 分析进一步表明 gp90 蛋白在重组质粒转染的DF1 细胞中获得表达，表达条带在 44-62 之间（图 5.2），其中 44 kDa 的蛋白与 gp90 经氨基酸序列计算的分子量相符，可能是未糖基化的 gp90 蛋白，而 62 kDa 的蛋白与 REV 病毒本身的囊膜蛋白 gp90 大小相符，以上蛋白均可以与 gp90 单抗发生特异性反应。

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第六章 全文结论

1.建立了 REV 动物感染模型，确定以病毒血症作为疫苗免疫效力的评价指标。2. 构建了表达 gp90 蛋白的重组酵母菌株，通过对酵母宿主菌、启动子、拷贝数和表达条件的优化，使重组 gp90 蛋白在摇瓶中的表达量达到 200 mg/L，发酵后达到 1.0 g/L。3. 利用酵母表达的重组 gp90 蛋白制备的亚单位疫苗对雏鸡和种鸡均安全有效。疫苗免疫程序为 3 周龄首免，间隔三周二免；使用剂量为 40 微克，免疫持续期为 6 个月；母源抗体可以为子代雏鸡提供良好的免疫保护。4. 表达 REV gp90 蛋白的 DNA 疫苗可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答，并对免疫鸡提供有效的攻毒保护；DNA 疫苗与亚单位疫苗联合免疫诱导机体产生了更高水平的免疫应答反应。

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参考文献（略）