1前言

Spoligotyping是以染色体中的直接重复区（ DR)为革巴序列的多态性分析，DR区只存在于结核分枝杆菌复合群中，由于不同结核分枝奸菌菌株中间隔区的个数和位置不同，由此产生的多态性成为基因分型的基础。只需要少量DNA，对样本质量要求不高，可用于临床标本的检测，同时其实验操作简单快速，并且结果数字化易于分析，有利于建立全球化的数据库，以供不同实验室间实验结果的比对。国际已有的数据库SploDB4. 0收录了来自122个国家的39295株结核分枝杆菌临床分离株的分型数据，包含1939个不同的基因型并把它们划分为不同的基因家族⑷。北京基因型菌株具有Spoligotyping特征性图谱，即1?34间隔区表现为缺失，因此这种方法非常适合鉴别北京家族。MLVA是采用多个VNTR的基因分型方法。VNTR为具有高度多态性，重复出现的DNA片段，这种片段种类多，变异范围大，提供了多种有高度遗传信息的多态性标记。这种重复序列的拷贝数在不同的菌株中各有不同，多位点的组合构成了菌株间丰富的多态性和高度的个体特异性，因此我们可以采用多个VNTR位点进行分型。

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2材料与方法

2.1实验材料

828分枝奸菌分离自新疆维吾尔族自治区和甘肃省。在新疆维吾尔族自治区胸科医院和甘肃省兰州市肺科医院收集门诊及住院部临床诊断为结核的病人作为调查对象，并采用本研究室的患者背景资料表进行背景调查，同时由患者本人签署知情同意书。收集的痰标本用在当地医院分离培养，由本实验室负责传代和培养。2005年至2011年间共收集菌株828例，其中新疆收集菌株317株（2011年之前分离171株，2011年分离146株），甘肃收集菌株511例（2011年之前分离200株，2011年分离311株）。其中女性患者339例，男性患者489例，年龄范围自1岁至90岁，但多数病人集中在20~60岁年龄段。结核分枝杆菌标准菌株H37RV购自中国药品生物制品检定所，由本实验室进行传代培养、保存。

2.2实验方法

在600ml蒸馆水中加入天冬酰胺和丙三醇，溶解后加入马铃薯淀粉混匀，lOOr水浴加热30分钟，呈现透明的糊状液体即成为基础液。新鲜鸡蛋表面洗净，浸泡在70%乙醇中30分钟后取出擦干，破壳将鸡蛋液用电动打蛋器撞拌均匀，用消毒纱布过滤。将600ml基础液和1000ml新鲜鸡蛋液充分混勻，然后加2%孔雀绿水溶液20ml,混匀，静置1小时后，分装至试管（18X180inm)中，每支试管分装7ml，斜置于架上，使培养基斜面占试管的2/3左右。将分装好的培养基放入温箱内85°C 2小时蒸汽凝固灭菌，24小时无菌测定合格后，4°C避光保存，于一月内使用完毕。

3 实验结果 ..........24

3.1菌种鉴定结果....... 24

3.2两宵区.......77

8株结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型分析 ........25

4讨论...........57

4.1两脊区结核分枝杆干菌Spoligotyping分型基因多态性 .........57

4.2两省区的基闪型分布....... 58

4.3 CAS家族菌株........ 59

5 论文小结 ......65

4讨论

4.1两省区结核分枝杆菌Spoligotyping分型基因多态性

之前的研究发现北京家族菌株在亚洲地区为主要的流行菌株并且在世界范围内也呈流行趋势。本次研究也再次证实了这一结论，本研究中虽然北京家族菌株占全部778株结核分枝杆菌的81.49%,但634株北京基因型菌株仅表现出16种基因型，基因多态性低，提示两地区中北京家族菌株传播速度较快。T家族菌株是本研究中发现的第二大流行菌株，占所分析菌株的5.78%，在我国其他省市自治区的研究中也发现了大量该基因型菌株，其发生率仅次于北京家族菌株，并且在其他国家和地区也发现了该种菌株的流行，但是T家族菌株具有很高的遗传异质性，没有统一的Spoligotyping指纹图谱特征，目前对该基因型尚无明确定义该家族菌株的大量出现提示我们应寻找能够准确定义这种基因家族的遗传标志物以加强对此类菌株的鉴定，从而对其致病性及流行特点等进行深入研究。

4.2两省区的基因型分布

新疆和甘肃两个地区虽然同处于我国西北部，并且位置相邻，但是山于地理位置和人口分布的不同，两地菌株的基因型分布也有一定差异。之前本实验室对我国十几个省市自治区的结果显示，北京家族菌株在所研究的地区中比例均占据绝对优势，在北方各省区的百分比要远高于南方各省区，见图4.1。在我国北方地区，例如北京，北京家族菌株占临床分离菌株的80-92.6%,天津占91.7%[气吉林占89.9%[25],西藏占96.3%[25-27],内蒙占93.26%[28];而在我国南方地区，广东北京家族菌株仅占临床分离株的25%，广西占55.3%,福建占54.5%125]。本研究屮甘肃地区占全部菌株的87.79% (410/467),与之前研究中我国北部地区北京家族菌株流行的状况相吻合（图4.1)，但是新疆地区菌株中北京家族菌株占72.03%，与其邻近的几个省区如西藏（90.38%)，甘肃（87.79%)和内蒙古（93.26%)相比，比例明显偏低，这可能与我们收集的菌株中维吾尔族和哈萨克族等少数民族病例占较大比例有关。

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5论文小结

一、通过对相关地区结核分枝杆?菌传播关系的研究，为针对性的制定结核传播的控制策略提供基础科学依据。二、研究发现当地主要流行菌株为北京家族，但两地的基因型别构成存在明显的差异，并发现了新的Spoligotype基因型，丰富了基因型信息。三、在甘肃地区首次发现了 CAS家族菌株；同时，在新疆地区发现分离22株具有独特分子特征的非北京家族基因型菌株，在与全国其它地区非北京家族菌株的聚类结果中独立自成一群，可能为具有地区特色的新的结核分枝杆菌基因家族。四、尽管本实验室标准化的15个VNTR位点的组合对全部实验菌株具有较好的分辨能力，但是对于同源性较高的北京家族菌株，具有较好分辨力的位点并不多，因此可以考虑针对不同地区，调整VNTR位点组合，必要时应考虑新的VNTR位点以保证基因分型的准确性和分辨率。另外，也可以考虑联合传统分型方法与SNP和LSP等能够准确定义菌株进化地位的多态性标记来提高对菌株的分辨力，以达到真正意义上的主水平鉴定。

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参考文献（略）