实验材料

一 、实验动物

雄性Sprague-Dawley大鼠                南华大学实验动物中心 

二、主要试剂

1.  Apelin-13 多肽(057-19)                 USA Phoenix Pharmaceuticals, Inc.

2.  BCA Protein Assay Kit                  USA HyClone-PIERCE Biotechnology, Inc.

3.  PI3 Kinase P85 Antibody                  USA Cell Signaling Technology, Inc.

4.  Phospho- PI3 Kinase P85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody  USA Cell Signaling Technology, Inc.

5.  Phospho-Akt (Ser473) Antibody           USA Cell Signaling Technology, Inc.

6.   LY294002 (PI3 Kinase Inhibitor)           USA Cell Signaling Technology, Inc.

7.  1701-1                               USA BioVision, Inc.

8 .  pERK1/2（E-4）、ERK1/2 (K-23)         USA Santa Cruz Biotechnology, Inc.

9.   Rabbit Anti-Cyclin D1                  武汉博士德生物工程有限公司

10.  Rabbit Anti- -Actin                    北京中杉金桥生物技术有限公司

11.  β-Tubulin(H-235)                      USA Santa Cruz Biotechnology, Inc.

12.  辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（HRP  Goat  anti-rabbit  IgG），山羊抗小鼠二抗       (HRP Goat anti-mouse IgG)                   武汉博士德生物工程有限公司

13.  Gibco LG-DMEM                      USA Invitrogen Corporation

14.  标准胎牛血清（FBS）                 中国医学科学院生物工程研究所

15.  噻唑蓝（MTT）、Trypsin 1:250           USA Amresco, Inc.

16.  Western Blotting Luminol Reagent         USA Santa Cruz Biotechnology, Inc.

17.  PVDF膜                             USA Millipore Biosciences, Inc.

18.  Prestained Protein Marker                纽英伦生物技术（北京）有限公司

19.  聚丙烯酰胺(Acrylamide)，亚甲聚丙烯酰胺(N，N’-Methylene  Bisacrylamide)， TEMED，过硫酸胺(Ammonium Persulfate)      USA Amresco, Inc. 

20.  Tris-Base、SDS、Glycine、TEMED       USA Amresco, Inc

21.  其他试剂均为国产分析纯 

实验方法

1．大鼠血管平滑肌细胞的培养

参照Campbell JC的组织贴块法。无菌条件下分离出7-8周龄120-150g雄性SD大鼠的胸主动脉，浸泡于装有适量无菌 PBS  (KCL  0.2g,KH2PO4  0.2g,NaCl 8.0g,Na2HPO4·12 H2O 3.61 g in 1 L solution, pH 7.4)的培养皿中清洗2-3次，轻轻剥离外膜、内膜和纤维结缔组织后，将血管中膜剪成1×1mm2大小的组织块，均匀排布于培养瓶内，加入少量含 20%胎牛血清的DMEM， 置于 37℃、5% CO2培养箱中孵育。3-5 天换液一次，待细胞长至 70%-80%融合时用 0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜观察：细胞呈梭形或长梭形，呈典型的“峰—谷”样生长。采用小鼠抗大鼠SM α-actin和小鼠抗大鼠 SM22α 免疫组织化学的方法在光镜下分别鉴定了大鼠血管平滑肌细胞的特异性α-肌动蛋白和特异性肌动蛋白重链。实验用长势良好的第4-10代细胞。

2．MTT 比色法检测 PI3K抑制剂 LY294002 和 Akt 抑制剂 1701-1 对apelin-13促 VSMCs增殖的影响

MTT 比色试验的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臢（formazan）并沉积在细胞中。二甲基亚砜（DMSO）等有机溶剂能溶解细胞中的甲臢,在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比,因此，常用来间接反映细胞增殖的活性。取生长良好的4~10代对数生长期VSMCs，以胰酶消化后，用含10% FBS 的DMEM制成细胞悬液，以5×104cells/ml 的密度接种于96孔板，200μl/孔，随机分组，每组设 4~6个平行孔，置于37°C、5%CO2培养箱中培养，待细胞长至70%~80%融合状态时，更换为含0.1% FBS的DMEM培养24h使细胞同步化，然后加入不同的处理因素继续孵育 24h，在孵育结束前 4h 每孔加入浓度为 5 mg/ml 的MTT 20μl，培养4h后倒去培养液，每孔各加入DMSO 150 μl，在37°C 温箱孵育30 min后震荡混匀，用酶联免疫检测仪测定光密度值（OD值，检测波长570 nm）。 

三、 英文摘要…………….3

四、 论文正文

（一） 前言………..4

（二） 实验材料………..7

（三） 试验方法………..9

（四） 实验结果……………..11

（五） 讨论………...26

（六） 结论……………...32

五、 参考文献………………….33 

讨论

心脑血管疾病是危害人类生命的最严重疾病之一，由于环境污染、饮食习惯的改变和生活节奏的加快，促使心脑血管疾病的发病率逐年上升。

高血压、动脉粥样硬化与血管成形术后再狭窄是导致冠心病、心肌梗死和脑卒中等心脑血管疾病的主要诱发因素。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）作为血管壁的主要细胞成分之一，在该类病变中扮演着重要角色，它是决定血管收缩/舒张和血管构型的重要因素。

血管平滑肌细胞起源于神经胚层（神经鞘）和在一定程度上发生分化（内皮、心外膜）的多种中胚层细胞。VSMCs 位于血管壁中膜，呈长梭形，长约 6um,宽约 2um,细胞核为圆形或椭圆形，多位于细胞中央。VSMC 的主要生理功能是通过舒缩作用调节血管的张力。VSMC 还可合成、分泌细胞外基质成分和多种细胞因子，并通过其表面的细胞因子和生长因子受体，接受不同因子对细胞的刺激从而发生细胞生物学行为的改变。血管平滑肌细胞可以增殖（伴随细胞数量增加的增生），肥大（细胞体积增加，DNA 含量不变），核内再复制（DNA 含量增加，细胞体积不变）和凋亡。各种刺激因素通过自分泌/旁分泌血管活性物质介导血管平滑肌细胞的上述各种反应。在与心血管系统有关的许多疾病中，血管收缩/舒张和血管构型皆会发生明显变化，均涉及VSMC 的参与。

血管平滑肌细胞有两种表型：收缩表型（高分化型）与合成表型（未分化型）。在胚胎发育过程中，VSMC 由未分化表型逐渐分化为具有成年特征的分化表型（differentiated VSMC）;  当血管受到损伤或体外培养的 VSMC 受到生长因子刺激时，VSMC 又从分化型转化为去分化型（dedifferentiated VSMC）并获得增殖能力，这个过程称为表型转化（phenotypic modulation）。由收缩型向合成型转化是细胞增殖的先决条件。生理条件下，血管平滑肌细胞存在着有序的增殖与凋亡，二者保持平衡，VSMC 通过收缩和舒张调节血管张力，通过分泌和释放血管调节因子维持血管正常功能。VSMC由中膜迁移到内膜下间隙并异常增殖是动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等疾病共同的细胞病理基础之一。

结论

1、Apelin-13通过 PI3K/Akt-ERK1/2- cyclin D1 信号通路促大鼠血管平滑肌细胞增殖。

以上结果揭示了 apelin/APJ 系统促血管平滑肌细胞增殖的新的信号转导机制，为进一步阐明高血压、动脉粥样硬化、再狭窄等血管增生性疾病的机理提供了新的视角，apelin-APJ 系统也可能成为筛选新药的重要作用靶点。

参考文献（略）