本文是中药药理学专业博士论文范文，主要研究药物免疫毒性评价关键技术。

第一部分人和食蟹猴、恒河猴的淋巴结、胸腺中不同免疫类型细胞表型及数量的差异性研究

胸腺是免疫器官毒性研究中最关注的器官之一，也是免疫系统发育中最重要的器官之一。胸腺在T细胞发育中起重要作用，因为T细胞在胸腺由原始细胞成熟为具有免疫活性的细胞。大多数不成熟的T淋巴细胞由皮髓质交界迁徙进入皮质后，最先到达被膜下的外皮质区，在此处T淋巴细胞转化为体积较大的淋巴母细胞。然后淋巴母细胞通过皮质转化为胞裝较少、深染的小淋巴细胞。最后，小淋巴细胞到达髓质成为中等大小的淋巴细胞。总之，这些发育转变的过程受到免疫表型的监控。任何未按指示正确释放的T细胞进入外周免疫器官，无论是出生前还是出生后，都有可能导致严重的自身免疫疾病，如T细胞介导的自我攻击、免疫减弱、严重畴形或功能障碍淋巴结皮质分为两个部分，分别是B细胞为主的淋巴滤泡，和T淋巴细胞为主的滤泡旁淋巴细胞尽管动物种属、年龄等存在差异，但是均受到外来抗原物质的影响，大多数动物淋巴结的生发中心结构比较一致。淋巴结组织形态的变化体现了机体对外源性抗原的反应。免疫应答反应出现在淋巴滤泡、滤泡旁淋巴细胞、髓窦或髓索中的一个或多个部位。研究者釆用CD3和CD20标记食蟹狼淋巴结、脾脏和肠枯膜相关淋巴组织（派氏结）。结果显示淋巴滤泡和生发中心的大小存在巨大的个体差异，淋巴结中T细胞丰富，而脾脏和派氏结中B细胞丰富。众所周知，在发育成熟过程中，与年龄相关的免疫系统变化包括表型改变和功能改变。通常免疫系统是从出生开始才开始发育的，多种免疫细胞发生明显的表型和功能变化往往也是非人灵长类动物出生后的数年。目前的研究更多地关注发育免疫毒理学，而缺乏免疫器官组织形态学特点动物与人的比较性研究。2005年美国毒性病理学会颁布了免疫系统病理学评价的最佳指导规范，提出免疫器官不同区域的不同类型细胞的构成变化是诊断免疫毒性的重要基础。此外,随着免疫组织化学技术的发展，病理学家可以从形态上对特定类型细胞进行半定量的分析。因而，本部分研究内容通过免疫组织化学方法，平行比较非人灵长类动物与人主要免疫器官胸腺和淋巴结T细胞、B细胞以及巨嗟细胞分布及数目的差异，以弥外了目前国内外关于非人灵长类动物与人之间免疫器官组织形态及各类型免疫细胞数量差异性的背景性知识，并为临床前药物安全性评价中动物毒性研究外推至人的风险评估提供科学支持。

材料和方法

1食蟹推、恒河狼及正常成人淋巴结和胸膝组织的收集

收集中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心自2004至2011年31项食蟹猴/恒河猴毒性研究试验阴性对照组动物，其中恒河猴76只（雄性37只、雌性39只），食蟹猴104只（雄性43只、雌性61只）。所选动物均为阴性对照组动物，给予生理盐水/注射用水/PBS/溶媒（甘露醇、蔑糖、碟酸盐类、聚山梨酯80等）。食蟹猴年龄2-3岁，体重约2.5-3.5kg。恒河猴年龄2-3岁，体重2.5-4.0kg。所有动物实验均符合动物伦理委员会关于动物护理和使用指南。正常健康人淋巴结和胸腺来源于中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心人体组织交叉反应标本库。其中淋巴结有11例，胸腺有4例。所有组织进行组织病理学检査未发现病变，为正常人淋巴结和胸腺

2主要试刑及仪器

主要试剂：实验所用正常羊血清工作液，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗详见表1-1; PV9000试剂盒，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试刻，(含浓缩DAB溶液20 X，DAB底物液），购于北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器：吉尔森移液枪，微波炉，普通显微镜，37°C恒温箱，滑动式切片机，CCD数码图像采集系统。

第二部分人和食蟹猴T细胞和B细胞功能的比较性研究

2000年欧洲医学委员会（EMEA)第一次提出在药物研发临床前阶段需要进行免疫毒性的评价。随后，国际协调委员会（ICH)联合欧洲、曰本、美国药监管理机构和一些大的制药厂的专家们针对于药物的免疫毒性评价起草制定了相应的指导原则ICHS8。该指导原则提供了评价具有潜在免疫毒性化合物的非临床实验方法，以及根据重要程度（Weight of Evidence )选择相应的免疫毒性实验。标准的免疫毒性简选实验包括以下.几个部分：（1)血液学的变化，主要推荐总白细胞系数和白细胞绝对分类计数等。（2)免疫器官重量、大体病理学及组织病理学的变化，如胸腺、淋巴结、脾脏和/或骨髓。（3)血清中球蛋白的变化，尤其是不同类别的血清免疫球蛋白的变化。（4)感染率的增加。(5)胖瘤发生率的增加。但是，该指导原则对于免疫毒性评价仅仅局限于动物模型的评价，并且只能针对免疫抑制和接触性过敏进行评价，不涵盖药物诱导的系统性过敏和自身免疫性疾病Valentina Galbiati等提出体外试验评价免疫毒性一方面有利于减少动物的使用，一方面体外试验的发展有助于采用人外周血进行药物免疫毒性研究。使得评价体系最大限度地与临床接近，从而更为准确评价药物对于人体的毒性作用。免疫功能体外试验逐渐受到人们的重视，发展和建立起多种针对不同免疫细胞的功能试验包括有NK细胞功能测定、淋巴细胞增殖试验、细胞因子分秘混合淋巴细胞反应（MLR)实验、细胞毒T淋巴细（CTL介导的试验）溶血空斑试验等。其中，MarkCoNinge等提出的人淋巴细胞活化分析（human lymphocyte activation assay, HuLA ),该试验可以监测多种免疫细胞如T淋巴细胞、抗原呈递细胞和抗体分泌B细胞的功能，是T细胞依赖的抗原反应试验（TDAR)的体外替代模式。该方法釆用小细胞，具有很高的灵敏性和特异性。然而，上述多种方法多数仍处于探索阶段，至今未能建立明确的指导原则对于多种方法进行标准化，用以临床前药物的安全性评价。

实验三 B细胞抗体形成功能测定实验.......... 81

材料和方法 ..........81

实验结果 ..........84

讨论 ..........87

参考文献.......... 89

第三部分T细胞激活剂及B细胞激活剂诱导的.......... 93

材料和方法 ..........93

实验结果 ..........95

讨论 ..........109

参考文献..........111

结论

研究总结本研究首次针对人和食蟹狼/恒河猴主要免疫器官（胸腺和淋巴结）和免疫细胞（T/B淋巴细胞），从形态学、免疫功能以及基因水平进行了比较性研究。从形态上，免疫组织化学方法结果显示，抗人CD20和抗人CD68单抗与食蟹猴/恒河猴B淋巴细胞和巨嗟细胞结合，无论是染色强度还是分布特点都与人类非常相似，显示出食蟹猴/恒河猴B淋巴细胞与巨嗟细胞种属间存在的高度遗传相似性。但是，抗人CD4和抗人CD8单抗与食蟹狼/恒河猴T细胞存在弱交叉反应或无交叉反应，这提示食蟹猴/恒河猴胸腺及淋巴结中T淋巴细胞与人存在差异，尤其是细胞毒性T细胞。有趣地是，尽管人淋巴结中T淋巴细胞和B淋巴细胞的含量均高于食蟹猴，但是T/B细胞的比例非常接近，这也提示了两种种属间一定的相似性。该部分内容的研究一方面弥补了国内外关于非人灵长类动物免疫器官特征性背景数据的缺乏，一方面也提出T淋巴细胞表面分子的无或弱交叉反应反映了食蟹猴/恒河狼与人类T淋巴细胞遗传关联的疏远，提示非人灵长类动物T淋巴细胞与人类的差异应该成为毒理学研究着开展免疫调节药物安全性评价的重点考虑之一。

从功能上，采用单抗诱导细胞因子释放、T/B淋巴细胞增殖试验以及B细胞抗体形成功能测定试验，比较了食蟹狼和人外周血PBMC细胞之间的差异。（1)单抗诱导细胞因子释放：研究发现人外周血PBMC细胞在ANC28.1 (CD28超级激活剂)作用下可以分泌大量的TNF-a和IFN-Y,而食蟹猴外周血PBMC细胞未见细胞因子的分秘。我们的研究首次在国内建立了体外细胞因子释放试验，该方法的建立有望成为单抗类药物免疫毒性评价的补充实验。这部分研究的内容与国外文献报道的结果类似。国外研究证实CD28超级激活刻诱导细胞因子的释放主要参与的细胞为记忆型效应T淋巴细胞，因此该实验证实了人和食蟹猴T淋巴细胞存在一定的差异。（2) T/B淋巴细胞增殖试验：结果显示给予非特异性T细胞激活劍PHA后，人和食蟹猴外周血PBMC细胞均表现出随激活刻浓度增加细胞明显增值。但是在相同浓度的激活剖下，人外周血PBMC细胞增殖幅度明显高于食蟹猴PBMC细胞的增殖。上述结果提示人外周血T淋巴细胞更敏感，更易受到相应激活刻的激活。因此，在动物免疫毒性研究中，与T细胞相关的免疫激活数据外推至人时需要慎重考虑。给予非特异性B细胞激活制LPS后，人和食蟹猴外周血PBMC细胞均表现出类似的增殖趋势。该结果显示人和食蟹猴B淋巴细胞在受到抗原刺激时的增殖反应相似。

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