本文是博士论文范文，主要研究CD44在肿瘤中的生物学功能。

第一章CD44在乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迀移中的生物学功能研究

前言

乳腺癌(breastcancer, BC)是危害女性健康最常见的一种恶性肿瘤，在女性肿瘤中排名第二位。尽管随着近几年诊断技术和治疗手段的不断完善，乳腺癌的发病率逐年下降，但是在西方国家每年新发病例仍有60多万[1]，在我国乳腺癌的发病率也呈现年轻化趋势。乳腺癌的转移是造成乳腺癌患者预后差，存活率低的一个重要原因。研宄表明，约有80%的女性患者接受药物治疗，其中超过40%的病人会再次复发或者是因为转移病灶的出现而导致死亡，所以提高我们对乳腺癌转移过程中分子机制的了解，有助于乳腺癌的治疗。乳腺癌的发病与多种因素有关，其中雌激素的活性对于乳腺癌的发生有重要的作用，内源性和外源性雌激素的长期刺激会导致乳腺癌的发生率较高，如月经初潮的年龄、绝经的年龄、未生育或晚育等，另外还有年龄、遗传和家族史、病毒、放射线和营养因素等因素都可以导致乳腺癌的发生。CD44分子最初作为粘附分子介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，随着研宄发现，CD44分子也可以参与细胞间的信号传导，并调节肿瘤的生长、侵袭、转移等过程。近年来发现CD44分子还是乳腺癌干细胞表面的一个重要表面标记分子，它在乳腺癌的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，其表达高低与乳腺癌的恶性程度以及预后状况息息相关。人CD44基因是位于11号染色体上的单拷贝基因，由20个高度保守的外显子组成，包括10个组成型外显子和10个变异型外显子。组成型外显子的转录片段存在于所有CD44转录子中，仅含有组成型外显子的CD44转录子为标准型CD44转录子（CD44S);变异型外显子在转录时通过选择性剪切将外显子VI到vlO串联插入到CD44跨膜结构域的胞外近膜序列，从而形成具有多种异构体的变异型CD44转录子（CD44V)。在不同的生长条件下，CD44分子还可以通过翻译后修饰，例如N端的糖基化等增加分子的多态性,使CD44的分子质量在80-120 kDa变化，参与调节多种生理活动。

CD44分子属于I型跨膜糖蛋白，在大多数真核细胞表面都有表达。其分子的多样性使其能和多种配体相结合从而调节细胞多种生理、病理过程，其在形态发生、器官形成、造血、淋巴细胞的归巢和迁移、白细胞的激活、效应分子作用、激活诱导的细胞调亡（ACID)等过程中发挥着重要的作用。相应的，当CD44分子表达异常或功能障碍时，能够引起血液的恶性肿瘤和多种自身免疫疾病等，并能参与某些实体瘤肿瘤特别是乳腺癌的发生、增殖、分化、存活、侵袭和迁移，以及细胞的调亡等[3，4]。大量研究表明，CD44分子在恶性肿瘤细胞中高表达，而在良性或转移性低的肿瘤细胞中低表达，而且其表达水平的高低与病人的预后情况密切相关。肿瘤细胞内高表达的CD44分子激活后，可以改变细胞周围微环境，促进肿瘤细胞释放碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和转化生长因子P (TGF-pi)，促进肿瘤细胞的生长。而CD44分子的天然配体透明质酸（HA)，可以连接CD44分子和Her2/ErbB2酪氨酸激酶，促进CD44分子和多种酷氨酸激酶相互作用，形成内源性调节互联复合物促进肿瘤细胞的增殖。除此之外，肿瘤细胞表面的CD44分子还可以促进单核细胞和肿瘤相关的巨唆细胞释放血管生成相关因子促进血管生成。CD44分子在肿瘤中的另一个重要功能是促进肿瘤细胞的转移。转移是恶性肿瘤预后不良和高死亡率的主要原因。CD44分子经过翻译后修饰形成硫酸乙酰肝素糖蛋白（CD44HSPG)与透明质酸结合，结合透明质酸后的CD44分子可以募集MMP-7和肝素结合的表皮生长因子前体（pro-HB-EGF)，从而在肿瘤细胞表面形成复合物。MMP-7可以水解表皮生长因子前体使其形成成熟的表皮生长因子激活Her2/ErbB4促进肿瘤细胞的存活、增殖和转移。而CD44和透明质酸的聚集对于MMP9与细胞表面结合和MMP9活性的激活非常重要。CD44和透明质酸结合可以作为描定蛋白使MMP9聚集于细胞表面，促进肿瘤细胞的转移。其中MMP9促进肿瘤转移的机制有两个。一方面MMP9可以降解细胞外基质（ECM)促进肿瘤细胞的转移[6，7]，另一方面MMP9还可以诱导TGF-P的成熟促进血管的形成从而促进肿瘤细胞的转移。另外透明质酸可以通过激活T细胞淋巴瘤侵袭转移因子l(Tiam-l)，与CD44形成Rhamm-CD44-ERKl/2复合物从而促进淋巴细胞和相关肿瘤细胞的转移。

第二章CD44在K562细胞增殖生物学中的功能研究

前言

慢性髓系白血病是一类骨髓恶性增殖性疾病，根据病程可以分为三个时期：慢性期（chronic phase，CP)、加速期（acceleratedphase，AP)和急变期（blast phase，BP)。慢性髓系白血病的主要发病机制是费城染色体(Philadelphia chromosome, Ph)的产生，而费城染色体呈阳性的慢性髓系白血病占慢性髓系白血病总数的90%，它是由位于9号染色体上的ABL基因与22号染色体上的BCR基因融合产生的⑴。BCR-ABL融合基因可以产生一个致癌蛋白BCR-ABL，它具有组成性酪氨酸激酶的活性，能够促进白血病细胞的增殖和存活，可以与下游的RAS、RAF、JNK、c-MYC和STAT等激酶相互作用，促进骨髓不依赖细胞因子的生长P_8]。最初对于慢性髓系白血病的药物治疗主要是白消安（busulfan)、经基脲和干扰素a (IFN-a)等。虽然干扰素a能够缓解病情延长患者的生存周期，但是由于具有较多的其它毒性而不能广泛使用。同基因的造血干细胞移植能够较好地治愈慢性髓系白血病，但是伴随着较高的死亡率和复发率，另外同基因干细胞移植受供体的限制而不能大量使用。由于费城染色体的发现而发明了小分子酪氨酸激酶抑制剂，它能够祀向针对BCR-ABL致癌蛋白很好的治疗Ph+的慢性髓系白血病。但是仍有一小部分患者天然的对酪氨酸激酶抑制剂不敏感，而且随着药物治疗时间的延长，许多患者出现了多药耐药现象使酷氨酸激酶抑制剂有其局限性[9]。尽管针对BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂作为一线药物治疗CML，但是它只能控制CML的发展而不能治愈。因为CML是一种造血干细胞异常的疾病，表达BCR-ABL蛋白的干细胞能够自我更新并能分化出CML中所有的白血病细胞。而且白血病千细胞"天然”对酪氨酸激酶抑制剂不敏感所以小分子的酪氨酸激酶抑制剂不能杀死白血病干细胞，这是白血病患者在停止治疗后很快复发的主要原因。因此增加对CML发病分子机制的研究有助于新的治疗措施的提出。

实验一不同肿瘤细胞系CD44基因的表达分析.........25

实验二沉默CD44基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞........30

实验三沉默CD44基因抑制MDA-MB-231细胞........37

实验四过表达CD44基因上调NHE1的表达促进........39

实验五MAPK信号通路在CD44介导乳腺癌细胞迁移........45

实验六小鼠体内实验验证CD44对乳腺癌细胞迁移........49

实验七CD44对NHE1表达调控的机制........55

结论

1.在不同的血液病患者细胞内均有CD44的表达，而CD44的表达具有差异性，但是均比正常对照高。而慢性髓系白血病细胞系K562细胞内CD44表达也显著高于正常人对照。

2.沉默CD44基因可以抑制K562细胞的增殖。当CD44表达降低可以促进p21的表达抑制Cylin D1的表达，从而使K562细胞处于Gq/Gi期阻滞，而K562细胞的调亡没有显著性的改变。

3.沉默CD44基因可以抑制Wnt/p-catenin信号通路。CD44表达降低可以减少P-catenin的表达、促进P-catenin的憐酸化从而减少P-catenin的稳定性减少其细胞核定位，抑制Wnt/p-catenin信号通路的激活，从而抑制K562细胞的增殖。

参考文献

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