第一章文献综述

鸡球虫与球虫病

球虫病造成的经济损失是惊人的，尤其对规模化养殖业危害严重。主要危害10?30日龄的雏鸡或35?60日龄的青年鸡，发病率可高达80%。病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢，词料报酬下降；成年鸡一般不发病，但作为带虫者，增重和产蛋能力降低，是传播球虫病的重要病源。在世界范围内，每年用于鸡球虫病的防治费用超过30亿美元[1],仅英国每年球虫防治上的花费就高达4000万英错，约占每年活禽销售财政收入的4.5%[2]。其中对养禽业危害最大的主要是柔嫩、巨型和堆型艾美耳球虫。其中，柔嫩艾美耳球虫主要寄生于盲肠，外形多为宽椭圆形，卵囊指数为1.16，最短潜伏期为115h。巨型艾美耳球虫主要寄生于小肠中段，外形为卵圆形，较大，卵囊指数为1.47，最短潜伏期为121h。堆型艾美耳球虫主要寄生于十二指肠，部分见于小肠前段，外形为卵圆形，卵囊指数为1.25,最短潜伏期为97h[2,3]。

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2鸡球虫的生活史

鸡球虫病是一类由专性肠道细胞内寄生的艾美耳原虫引起的一种常见且危害严重的动物寄生虫病。鸡球虫属于顶复合器门、孢子虫纲、真球虫目中的艾美耳属（Eimeria)，主要包括堆型艾美耳球虫(?E.acervuhna、、布氏艾美耳球虫(^E.brunetti)、巨型艾美耳球虫E.maxima)、和缓艾美耳球虫CE.mitis)、毒害艾美耳球虫(iE.necatfix、、早熟艾美耳球虫、E.praecox~)和柔嫩艾美耳球虫化teneUa)等7种，它们在鸡肠道内寄生部位不一且致病力也不尽相同。鸡球虫生活史为直接发育型，不需要中间宿主，具有明显的宿主特异性。发育需要经过体外抱子生殖和体内裂殖生殖、配子生殖三个阶段（图1-1)。球虫卵囊从感染湾只体内排出后，在外界适宜的温度、湿度以及充足的氧气的环境下，虫卵将发生孢子化，形成有感染性的抱子化卵囊，经孢子化成熟的卵囊在被鸡吞食后，在肌胃中被物理机械研磨力致卵囊壁破裂，释出4个孢子囊，而孢子囊又在十二指肠至小肠中部通过胆汁和酶（主要是胰蛋白酶）的作用下，在抱子囊的斯氏体（stieda body) 一端处破裂，并释放出子孢子。而后，子孢子再入侵粘膜上皮细胞内，首先子孢子变成球形。在感染的1?2天内，球形子孢子继续增大，变成内含有数个到数百个不等的裂殖子的裂殖体。随后，裂殖体破裂，裂殖子通过与子孢子相似的方式再入侵肠上皮，并再次形成球形裂殖体。从这种裂殖体逸出的裂殖子再次侵入肠粘膜细胞，如此经反复数次裂殖生殖之后，裂殖子不再形成裂殖体，转而发育为有性生殖体，即雌性的大配子体和雄性的小配子体。经1?2天后，配子体成熟，小配子体中形成大量小配子。单个的小配子外形呈瓜子状，具有新月形的头部和两根游离鞭毛，可以活泼地游动。这些小配子在运动过程中，一旦接触大配子，头部的鞭毛立即脱落，完成和大配子核的融合，即完成受精过程，形成合子。受精的合子表面立即出现受精膜，以防止其他小配子再次进入。约在1天时间内，合子外壁增厚，形成卵囊，卵囊从肠道粘膜脱落，随粪便排出体外。排出的未成熟卵囊一般在一定的温度（28°C),经1~2天即可完成孢子化，发育形成为成熟的抱子化卵囊。

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第二章组织蛋白酶B的克隆、表达和活性

引言

鸡球虫病是由顶复合门艾美耳属球虫引起的一种寄生虫病，可对养禽业造成重大的经济损失。对鸡球虫病的控制措施主要依赖于化学药物预防，但目前抗药性和药物残留H趋严重，急需人们开发新药或找到新的药物紀点来控制鸡球虫病。组织蛋白醜B是一类半胱氦酸类蛋白酶,属于木瓜蛋白家族，研究表明，它在寄生虫的生存、与宿主细胞的相互作用、致病性以及逃逸中都发挥了重要的作用。在与球虫相似的其他顶复合门的寄生虫中，已经发现并克隆了类组织蛋白酶B蛋白基因，他们在虫体入侵和入侵相关蛋白的成熟加工中发挥着重要的作用。组织蛋白醇B在球虫中研究报道较少，有何作用，是否有可能成为控制球虫病的新型点尚不清楚》2013年，Marie[127]和Anais[128]等分别对尺tenella的cathepsinB生化特性和表达进行了报道。与此同时，本实验通过序列分析，运用RT-PCR技术也扩增得到球虫的组织蛋白酶B基因，并构建质粒于大肠杆菌中表达，为球虫组织蛋白酸B基因进一步研究奠定基础。

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材料与方法

1材料

1.1实验动物

1日龄AA肉鸡购自北京市华都肉鸡公司，孵出后未落地前放在专用鸡盒中取回，在严格消毒后的无球虫笼舍里词养至试验日龄，保证词料和饮水无球虫污染，饲喂农标普瑞纳公司专门生产的不添加任何抗球虫药物的维鸡料。

1.2 Houghton株柔嫩艾美耳球虫

由英国动物卫生研究所的Martin W.Shirley博士惠赠，由中国农业大学寄生虫教研组保持，每隔6个月经鸡体复壮一次。

1.3 克隆载体 pEASY-Tl Cloning Kit

北京全式金生物技术有限公司产品。pEASY-Tl Simple Cloning Vector：适用于TA克隆，无多克隆位点，提供氧节青霉素和卡那霉素两种筛选标记，包含LacZ基因，在含有IPTG, X-gal的平板培养基上，可进行蓝白斑蹄选。

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第三章组织蛋白酶B在生活史不同阶段的........ 40

引言........40

材料与方法........45

结果 ........48

讨论........49

小结........50

第四章组织蛋白酶L的克隆、表达和活性........ 50

引言........ 50

材料与方法........ 50

结果........59 

讨论........67

小结........ 68

第五章组织蛋白酶L的酶动力学与抑制动力学研究........ 69

引言 ........69

材料与方法........ 69

结果 ........71

讨论........72

小结........74

第六章组织蛋白酶L在生活史不同阶段的表达水平与免疫保护研究

引言

由于cathepsinL在寄生虫的致病性中起着极其重要的作用，我们在前期的工作中利用生物信息学和分子生物学的方法克隆获得了 EtcatL基因的全长,利用原核表达载体在E. coli中体外重组表达EtcatL,优化表达策略，得到具有一定活性的重组蛋白。本研究通过利用纯化的重组表达蛋白免疫BABL/cSPF小鼠，获得抗EtcatL的高免血清，通过real-time PCR和westem-blot的方法确定了组织蛋白酶在生活史不同阶段的表达情况，为进一步研究其在球虫发育和致病过程中的作用提供基础。通过免疫保护实验证明了组织蛋白酶L可作为抗球虫亚单位疫苗的候选分子。

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结论

1.成功克隆并表达了 E.tenella的cathepsin B基因，证明其活性。结果显示原核表达的cathepsinB在明胶酶谱中有一定的活性，但活性较弱不足以进行生化分析。Real-time PCR和westem-blot的结果显示Etcat B在配子体和裂子体时期表达较高，未孢子化和子孢子阶段表达相对较低，抱子化过程中逐步增加，说明Etcat B可能在球虫的肠道寄生生活中其作用。亚细胞定位研究表明. Etcat B定位于￡. tenella的顶端，Etcat B可能参与了顶复合器蛋白的加工。

2.成功克隆并表达了 EMlla的cathepsin L基因，用明胶酶谱初步验证其活性，并进一步进行生化分析，结果表明，rEtcat L可有效利用底物Z-Phe-Arg-AMC (rEtcat L对Z-Phe-Arg-AMC的Km =8.9 nM，Vmax = 5.7 RFU/s uM),半胱氨酸类蛋白酶特异性抑制剂E64可有效抑制其活性（IC50为65.32±3.02nM)。温度对_活影响实验显示，.重组蛋白在25°C-5°C之间均有活性，在42°C活性最高，与鸡肠道温度一致，这可能是Etcat L对肠道寄生生活的适应。通过Real-time PCR和westem-blot的方法检测Etcat L表达水平。结果显示：Etcat L主要表达于裂殖子和配子体阶段，孢子化过程中Etcat L在抱子化的末期表达增加，说明Etcat L在球虫外生发育阶段和抱子化起始阶段发挥作用。免疫保护实验显示，与感染组相比，免疫100mg和200 ng rEtcatL后体重损失减少率分别时48.1％和48.9%,病变记分减少率为29.7%和40.5%,卵囊相对产量33.5%和59.0%。说明EtcatL对鸡抗球虫感染有一定的保护力。

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参考文献（略）