绪论

猪链球菌(Str-eptococcus aids)是最重要的猪病原体之一，其在猪咽部可正常携带，通过淋巴循环进入血循环后可导致脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、多装膜炎、肺炎等，给各国养猪业造成巨大的经济损失[1]。猪链球菌也是一种重要的人兽共患病原之一，人与被感染的猪及污染的猪制品接触时，猪链球菌可通过皮肤伤口进入机体导致感染，此外，还可因吃被污染的生猪肉或喝生猪血而感染[2-4]。人感染猪链球菌可以引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、败血症休克等症状，还可导致急性死亡[5，6]。目前，全世界报告的猪链球菌病例共400多例[1]，大部分病例来自亚洲，其中尤以2005年7月，发生在我国四川的人感染猪链球菌暴发疫情最为严重，造成215人感染、39人死亡[7-9]。2005年以前，猪链球菌根据荚膜多糖（capsularpolysaccharide, CPS)的抗原性不同分为35个血清型。

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第一部分33种血清型多重PCR检测方法的建立及部分变异cps cluster的分析

前言

据2005年Janet等人的研究，将原来的猪链球菌32与34血清型参考菌株鉴定为鼠口链球菌、Str印tococcusorisratti),故目前公认的猪链球菌血清型为1?31、33与1/2型，共33种[10]。尽管不同血清型与致病性之间还未有研宄显示有明确关联，但绝大部分国家血清2型是最常见的优势血清型。不同的地区血清型流行的型别也有一定差异，分离自病猪的猪链球菌除2型最多外，在亚洲依次为3、4、5、7、8与1/2型[11-13];欧洲为9、1与14型|；14-16];在加拿大2、3与1/2是最常见的血清型[17，18]。在人感染猪链球菌的报道中，最常见的血清型别也是2型[19]，此外，血清1、4、5、14、16与24型的感染也有报道[20-24]。

材料与方法

引物设计用 Primer-BLAST 程序,为了使引物能在多重PCR反应中同样的条件下有效工作，在引物设计时尽量使其拥有共同的物理特性，引物长度在20-24bp之间，预测的退火温度在47.91-50.94 °C之间，预期扩增产物片段为153?1,006 bp。据文献显示?基因是MLST分型时用到的7个管家基因之一，且其是7个管家基因中变异度最小的一个[46]，故我们选择淡基因用于质控基因，我们比对了各血清型的f/uvl基因，针对保守区域设计了一对用于mPCR质控的引物，预期扩增产物片段为120bp。引物由北京生工合成后溶于TE缓冲液lOmMTris-Cl、1 niMEDTA[pH 8.0。用于本研究中的引物及IE基因GenBank登记号见表2。每个mPCR反应体系除了引物，其它组分均相同。反应液为2xTaq PCR MasterMix包含DNA polymerase: 0.05 units/foL; MgCb. 4 mM; dNTP: 4 mM禾口buffer(Biomed、Beijing、China),反应总体积为20 ^L,包含10^il 2PCR Master Mix、及每条引物0.2 (终浓度为0.2xM)，模板DNA，dciHsO补足至20 pL。扩增反应参数为：94°C变性5分钟，94°C变性30秒，58°C退火40秒，72°C延伸50秒，30个循环后，72°C延伸5分钟。产物上样于001(1611716%染色的2%琼脂糖凝胶，160V电压电泳50min后，凝胶成像系统拍照分析。PCR产物均经测序验证。

第一部分33种血清型多重PCR检测方法的建立及部分变异cpscluster的分析...... 7

材料和方法..... 9

结果....... 21

讨论.......33

第二部分10种新型c/w clustei?的分析及其多重PCR检测方法的构建 .......36

材料和方法...... 36

结果.......... 43

第二部分10种新型cps cluster的分析及其多重PCR检测方法的构建

引言

在第一部分的研究中所检测的346株猪链球菌，仍有186株用血清凝集实验和所建立的鉴别33种己知血清型的mPCR方法都不可分型，为了探寻其中的原因，我们根据不同的MLST型别从中选择了 32株进行了全基因组测序，通过对它们的cps cluster的分析，我们发现了 10种新的cps基因型别。并且针对每个型别的型特异基因我们建立了 2组mPCR体系来鉴定这些新cps基因型别。

材料与方法

新型C/W的截取、基因命名、注释同第一部分。VectorNTI及Adobe IllustratorCS4用以呈现新型cluster的基因构成与组织方式。新型别的基因的同源群(homology groups, HG)分类方法参照了Okura等人报道的方法[51]，相应蛋白序列一致性大于50%且匹配长度大于50%。为了与33种公认血清型基因的对比分析，同时为了便于读者理解,我们对新C/W型别中基因的HG编号沿用了 Okura等人的方法。我们根据Okura等人的方法[51]，将33种血清型与新型进行了层序聚类分析（Hierarchical duster analysis)。每个qw基因的HG按照存在和缺失编码一个二进制表格，存在标记为“1”，缺失标记为“0”。将此二进制数据表格导入Cluster3.0[60],用average linkage方法和Euclidean distance matrix进行层序聚类，以此来表示各型总体C/JS的关系。ClustalW程序用于33种血清型参考菌株与新qw型别的wg基因及5'端前4个保守基因c/wMCD的序列比对[47]，用MEGA5.0的neighbor-joining方法构建它们的系统发生树[48]。Artemis Comparison Tool (ACT)用来呈现qw基因簇的序列相似性（tblastx) [49]。

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结论

Wei等人报道了2003?2007年中国分离自病猪的猪链球菌的特征[12],血清型分布以血清2型最多（43.2%),依次为血清3 (14.7%)、4、8、5、7和1/2(3.2-6.4%)型。而在本研究中，如图13所示，所检测的346株猪链球菌中，可鉴定的血清型或qw型别中，最多的是新型（15.0%)，依次为21/29型（13.3%),新cpd/型(5.8%)与新(5.8%)，新cpsIJI型(5.2%)与30型（5.2%)等。而血清2型只占2.3%。本研究中血清型的分布与以往报道差异较大，可能是由于我们实验中所检测的菌株均分离自健康猪，而以往的报道大部分均分离自病猪或病人。由此可以推测，在健康猪中可能与病人及病猪中的猪链球菌的血清型分布是不同的。在本研究中仍然有55株分离菌株用血清凝集实验和setl?6的mPCR检测方法都不可鉴定，我们认为在这些菌株中有可能还存在着新的qw型别，当然也不能排除我们建立的mPCR方法有假阴性的现象。在以后的工作中，这些不可鉴定的菌株将会进一步研究。此外，我们将挑选荚膜包被较好的拥有新型C/W cluster的菌株免疫动物制备抗血清，尽早在生物学表型上证实它们属于猪链球菌新的血清型。

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参考文献（略）